目的 拟构建蛋白转导结构域(PTD)4-铜/锌-超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)原核表达质粒,纯化制备PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,探讨其穿膜能力.方法 设计合成hCu/ZnSOD引物,扩增hCu/ZnSOD cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒PET16b-PTD4进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;获得PET16b-PTD4-Cu/ZnSOD(CDs)原核表达载体,导入感受态E.coli BL21(DE3)中,进行扩增培养,收集菌体,将其裂解离心、Ni+2亲和层析、收集目的蛋白.融合蛋白孵育人心肌细胞,免疫荧光法检测融合蛋白穿膜能力.结果 通过测序证实实验扩增所得的PTD序列与设计的预期序列一致.设计并简并PTD4-Cu/ZnSOD基因长度为567 bp,通过引物进行正反向测序证实该序列与已被登录的GEN-BANK中Cu/ZnSOD序列相一致,并构建了相应的原核表达质粒.并在E.coli BL21进行大量表达,最终收集的PTD4-Cu/Zn-SOD具有良好水溶性.SDS-page分析显示构建的PTD4-Cu/ZnSOD分子量约为20 kDa,与预期的蛋白分子量20.45 kDa相符合.融合蛋白可以穿透心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性.结论 成功地构建了PET16b-PTD4-Cu/ZnSOD原核表达质粒,获得了可穿透心肌细胞膜的PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,为应用Cu/ZnSOD治疗缺血性疾病的研究奠定了

作者：王宇；刘菊英；王贤裕；柯昌斌；李瑞明；王晓勋

来源：安徽医药 2018 年 22卷 2期