目的 利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质Gla蛋白(MGP)基因敲除的RAW264.7巨噬细胞系,明确MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用.方法 利用在线软件分析并筛选出3个针对MGP基因外显子区的单链向导RNA(gRNA),人工合成gRNA寡核苷酸序列,并将其插入线性化的LentiCRISPRv2质粒中,构建成LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重组质粒.将重组质粒与psPAX2、VSVG包装质粒一同转染293-T细胞,包装并收集重组慢病毒,将其感染RAW264.7细胞.经嘌呤霉素筛选得到稳定RAW264.7细胞系,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)验证MGP mRNA及蛋白表达水平.qPCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况.结果 成功构建了LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重组质粒,成功包装了含有MGP-gRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达MGP的RAW264.7细胞系.qPCR及蛋白质印迹法检测显示,其MGP mRNA、蛋白表达显著性下调(P<0.05).qPCR结果显示,最具有代表性的LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1细胞破骨标志分子Itgb3(2.29±0.17)、Acp5(2.86±0.15)、Ctsk(2.07±0.13)的mRNA水平均显著上调(P<0.05).结论 利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了MGP基因敲除的RAW264.7细胞系,敲除MGP后RAW264.7细胞破骨分化能力增强.

作者：赵俐婷；王乃宁；贺芳；张燕

来源：安徽医药 2019 年 23卷 12期