目的:构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础.方法:以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1 770 bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)hISO.经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定.结果:经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68 860,将融合蛋白进行纯化,经40和60 mmol·L-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白.结论:成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达.
作者：邵敏；王新颖；刘星；王燕；周鹤峰；葛正龙
来源：吉林大学学报（医学版） 2016 年 42卷 1期
