目的:构建一种可经米非司酮诱导的真核表达载体,并用荧光素酶报告基因鉴定其调控作用.方法:利用分子生物学技术,将萤火虫荧光素酶LUC基因和启动子,以及米非司酮调控系统构建成单一的质粒载体pDC-RULUC,为减少两个转录单元之间的潜在干扰,加入了1.2 kb的绝缘子.通过PCR扩增和限制性酶切及测序分析鉴定载体的正确性.利用Lipofectamine2000试剂盒转染载体pDC-RULUC至体外培养的SW620细胞,将载体pGL3-Control和pGL3-Basic的转染分别设为阳性和阴性对照组,各组均同时转染pRL-TK载体作为内参照.实验组细胞在不同浓度(0、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10mol/L)的米非司酮培养液中孵育48 h后,采用双荧光素酶报告基因测试系统检测荧光素酶相对活性.复孔组则予去除培养液中的米非司酮并继续孵育48 h后行荧光素酶相对活性检测.结果:PCR和限制性酶切及测序均证实了载体的正确性.加入诱导剂米非司酮后,荧光素酶的相对活性随着培养液中米非司酮的浓度增高而增加,当米非司酮浓度达到1×10-6 mol/L时,最高可以实现荧光素酶的50余倍的表达,而去除诱导剂米非司酮后,几乎检测不到报告基因的表达.结论:成功构建了新型的米非司酮诱导调控系统载体,可以在体外实现对目的基因表达的有效调控,为进一步的基
作者：陈坚；薛绪潮；方国恩；苏长青；钱其军
来源：第二军医大学学报 2008 年 29卷 4期
