目的 构建BC047440基因RNAi慢病毒干扰载体,并检测其对人肝癌细胞系HepG2细胞中BC047440基因的沉默效果.方法 针对已经筛选确定的BC047440基因 RNAi有效靶序列,合成BC047440基因特异性shRNA序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-iRNA载体连接产生pFU-GW-shBC047440慢病毒载体,PCR、DNA测序鉴定阳性克隆.用脂质体转染法将pFU-GW-shBC047440、pHelper 1.0载体和 pHelper 2.0载体共转染293T细胞,产生具备感染能力的慢病毒.以293T细胞中绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度,并测定其对人肝癌细胞株HepG2细胞最适感染复数(MOI).以最适MOI感染HepG2细胞,分BC047440-shRNA组、control-shRNA组和HepG2组;RT-PCR和 Western blot检测各组细胞 BC047440 mRNA及蛋白的表达差异.结果 经PCR鉴定,成功构建BC047440基因RNAi慢病毒载体.测定慢病毒滴度为5×108 TU/ml,其在HepG2细胞中最适MOI为20;RT-PCR和Western blot检测结果分别显示 BC047440-shRNA组中 BC047440 mRNA及 BC047440蛋白表达较 control-shRNA组和 HepG2组明显降低,control-shRNA组与HepG2组间无明显差异.结论 成功构建BC047440特异性RNAi慢病毒载体,感染人肝癌细胞系HepG2细胞后,实现了对 HepG2细胞中BC047440基因的有效沉默.

作者：钟扬；李靖；黄小兵；郑璐；杨彤翰；赵弘智；梁平

来源：第三军医大学学报 2010 年 32卷 8期