目的 构建靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,并验证其对AGS胃癌细胞增殖的影响. 方法 设计并合成5对针对人YWHAE基因的shRNA序列,分别克隆入pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达质粒,接着将重组的慢病毒表达质粒和包装质粒PHR、包膜质粒VSVG一起采用磷酸钙法转染293T细胞包装慢病毒,收集制备的慢病毒感染AGS细胞,用抗生素Puromycine进行筛选.Western-blot检测感染细胞YWHAE蛋白的表达.选取干扰效率最高的慢病毒表达质粒,针对性设计siRNA的点突变引物,重叠延伸PCR法扩增获得点突变的YWHAE基因,克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A载体,构建YWHAE点突变的表达质粒,转染YWHAE沉默效果最好的AGS细胞株,Western-blot检测转染细胞YWHAE蛋白的回复表达.采用MTS法检测YWHAE-shRNA慢病毒对AGS细胞增殖的影响. 结果 5对针对人YWHAE基因的shRNA序列构建的慢病毒中,pLL3.7-siYWHAE-5包装成的慢病毒抑制AGS细胞的YWHAE蛋白表达的效果最明显,仅为对照组相对表达量的(0.269±0.083)倍;pLL3.7-siYWHAE-5包装的慢病毒,其干扰效应可经由YWHAE点突变表达质粒回复.与对照组比较,YWHAE-shRNA组AGS细胞增殖能力明显下降. 结论 成功构建了靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,获得YWHAE基因表达显著下调的AGS细胞株;探明YWHAE表达的下调可

作者：张晓艳；温春燕；吕玉华；陈豪；佘菲菲

来源：福建医科大学学报 2017 年 51卷 3期