目的 构建pDZ-EGFP的真核表达重组质粒,转染MDCK细胞,建立增强型绿色荧光蛋白稳定转染的报告细胞系,提供更为直观、快速的检测甲型流感病毒的新途径.方法 将PCR扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入到pDZ载体中,将获得的pDZ-EGFP重组质粒用lipo-fectamine 2000转染MDCK细胞,通过G418进行选择培养,建立稳定转染的细胞系.传至3代,提取细胞总DNA,用EGFP的特异性引物进行PCR扩增及测序,鉴定细胞报告系统的稳定性；接种标准甲型流感毒株,用荧光显微镜和蛋白免疫印迹法检测EGFP的表达情况验证其应用性；另外,接种临床样本100份,用EGFP细胞报告系统检测的结果与Real-time RT-PCR检测结果进行比较,鉴定细胞报告系统的特异度和灵敏度.结果 稳定细胞系经传至3代,特异性EGFP引物利用PCR扩增到816bp的目的条带,测序结果与扩增的EGFP基因序列100％符合；稳定细胞系接种标准甲型流感毒株,24h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的增强表达,72h后用细胞裂解产物与EGFP的特异性抗体反应,获得目的条带；EGFP细胞报告系统检测的100份临床样本与Real-time RT-PCR检测结果相比,其特异度和灵敏度分别为88.52％和89.74％.结论 成功构建了pDZ-EGFP真核表达载体及稳定转染的MDCK细胞系,为甲型流感病毒的细胞培养鉴定及后期的
作者：崔淑娟；孟冬梅；彭晓旻；石伟先；杨鹏；黄芳；王全意
来源：国际病毒学杂志 2012 年 19卷 1期
