目的:建立红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)标记的单纯疱疹病毒1型TK基因(Herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)的基因转移系统,并验证其有效性.方法:以pBLuescript-TK为模板,设计引物,将聚合酶链反应(PCR)扩增到的TK基因克隆到真核表达载体pDsRed2-N1中,获得以红色荧光蛋白为报告基因的重组质粒pDsRed2-N1-TK,利用脂质体转染体外培养的HepG2细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pDsRed2-N1-TK在细胞中的分布和定位,用RT-PCR方法验证其mRNA和蛋白质的表达.结果:空载体pDsRed2-N1转染组中,HepG2细胞内红色荧光呈弥散分布;重组质粒pDsRed2-N1-TK转染组中,红色荧光集中在细胞核中,随着表达量的增加,红色荧光在细胞核中聚集成团块状,2周后稳定表达于细胞浆中;RT-PCR的结果表明,HSV-TK基因在重组质粒转染组中有表达;丙氧鸟苷(GCV)杀伤效应确证了TK基因表达产物胸苷激酶的活性.结论:pDsRed2-N1-TK融合基因真核表达载体在真核细胞HepG2中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有TK和RFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为HSV-TK/GCV治疗肿瘤研究提供了实用而又方便的工具.
作者：王炜煜；曹利民；司进；王健；易继林
来源：贵阳医学院学报 2005 年 30卷 4期
