目的 以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体.方法 利用限制性内切酶Kpn I+Xba I从pCMV5质粒中切下目的 基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,Pine I酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的 基因的重组体质粒Ad-hNET,Pac I酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒.采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度.结果 测序结果证明hNET序列的正确,PCR、Pac I酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功.扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL.结论 成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作.
作者：贾志云；欧晓红；魏海燕；邓候富；黄蕤；王金蓉；张仕琼
来源：四川大学学报（医学版） 2008 年 39卷 4期
