目的 构建人端粒酶RNA组分( hTR)的真核表达载体,并对其生物学功能进行初步检测. 方法 以人胚肾293 T细胞RNA逆转录得到的cDNA为模板,采用PCR技术扩增出hTR编码序列,将其插入到pCDNA 3 .0载体中;将重组质粒与空载体分别转染293T细胞,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)检测其表达情况,在HepG2细胞中构建此基因的稳定细胞系并用qRT-PCR检测其效果,通过RNA结合免疫共沉淀( RIP )实验验证其和人端粒酶逆转录酶( hTERT )及角化不良蛋白( dyskerin )的相互作用,通过端粒酶重复序列扩增技术( telomerase repeat amplification protocol ,TRAP)检测过表达hTR后HepG2细胞的端粒酶活性. 结果 双酶切和测序结果表明,pCDNA3.0-hTR的真核表达载体构建成功;转染293T细胞用qRT-PCR证明成功表达;qRT-PCR证实HepG2 pCDNA3.0-hTR稳定细胞系筛选成功;RIP实验证实了hTR与hTERT和角化不良蛋白之间存在相互作用;TRAP实验发现过表达hTR并不影响HepG2细胞的端粒酶活性. 结论 成功构建了pCDNA 3.0-hTR真核表达载体,为进一步研究以针对hTR为靶标的癌症治疗奠定了基础.
作者：营孙阳；熊加秀；麦洪旭；林佳佳；姜丽娜；程龙；叶棋浓
来源：军事医学 2016 年 40卷 2期
