目的：利用CRISPR／Cas9基因编辑系统敲除小鼠源肝癌细胞H22中的GP73基因，构建H22细胞GP73基因敲除的稳定细胞株。方法根据CRISPR／Cas9靶点设计原则，设计2条特异性识别GP73基因启动子的上下游sgRNA，利用载体pX459质粒，构建2对重组真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后，将重组质粒转染至H22细胞内，使用嘌罗霉素加压筛选稳定敲除GP73的H22细胞株，利用免疫印迹检测重组质粒对内源GP73的敲除效果。MTT实验检测GP73被敲除后对细胞增殖能力的影响，再利用划痕实验检测细胞的迁移能力。结果免疫印迹结果说明敲除GP73基因的小鼠源H22细胞株内无GP73蛋白的表达；并且GP73被敲除后，H22细胞的增殖能力和迁移能力减慢。结论通过CRISPR／Cas9系统获得了靶向GP73基因的重组质粒，并且筛选出了稳定干扰GP73表达的细胞株，从而为探讨GP73在肝癌发生中的作用奠定基础。
作者：陈健康；魏从文；梁慧；王贝晗；钟辉；杨晓莉
来源：军事医学 2016 年 40卷 7期
