[目的]克隆绿盲蝽Apolygus lucorum核受体基因E75D全长,明确其表达谱,并获得该基因的重组蛋白及制备其单克隆抗体.[方法]利用RACE法克隆绿盲蝽核受体基因AlE75D全长;qRT-PCR法分析绿盲蝽不同日龄成虫(1-16 d)及7日龄雌成虫6种组织(脂肪体、飞行肌、卵巢、马氏管、中肠和表皮)中该基因的mRNA相对表达水平;利用Nde Ⅰ和XbaⅠ双酶切含有目的基因的pMD18-T载体后进行亚克隆,再利用IPTG诱导的重组质粒进行特异性表达重组蛋白,通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析纯化靶蛋白;最后通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备重组蛋白的单克隆抗体,Western blot验证该抗体的特异性.[结果]从绿盲蝽中克隆获得蜕皮激素核受体基因AlE75D(GenBank登录号:KX912700),其开放阅读框长1 911 bp,编码636个氨基酸,预测分子量为75.68 kD;该基因编码蛋白具有E75D的典型特征,由A/B域(23 aa)、D域(85 aa)、E域(190 aa)和F域(338 aa)组成,但缺失C域;绿盲蝽AlE75D的氨基酸序列与半翅目蝽科的豆荚草盲蝽Lygus hesperus的E75D序列一致性最高(为98％).AlE75D在整个绿盲蝽成虫期均有表达,在7日龄雌成虫中达到峰值;此外,AlE75D在雌成虫6个供试组织中也均有表达,并在脂肪体及卵巢中高表达.双酶切后的重组克隆载体可成功亚克隆到pCzn1载体上,IPTG可
作者：谭永安；赵旭东；肖留斌；孙洋；赵静；柏立新；郝德君
来源：昆虫学报 2017 年 60卷 9期
