目的构建实时荧光定量PCR(FQ-PCR)标准以定量检测原癌基因c-met mRNA的表达.方法以Trizol裂解抽提法提取新鲜肝组织总RNA.以RT-PCR法制备c-met cDNA目的片段并进行扩增;以A-T载体克隆法将纯化的目的片段与pGEM-T Easy Vector连接成重组质粒并转化E.coli DH5α.采用碱裂解法提取重组质粒,联合用直接PCR、α互补法和氨苄青霉素筛选法、EcoRⅠ限制性酶切和序列分析法鉴定其特异性.用聚乙二醇沉淀法纯化质粒并测定A260,从而确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备FQ-PCR梯度浓度标准.结果 c-met cDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性.结论成功构建了c-met实时FQ-PCR参考标准.
作者：岑东；吕建新；裴仁治
来源：临床检验杂志 2005 年 23卷 2期
