目的构建肌酸激酶MM同工酶原核表达系统,纯化重组酶蛋白并对其稳定性进行研究,为其作为参考品或校准品应用于临床奠定基础.方法提取胎儿心肌组织总RNA,反转录扩增人肌酸激酶M亚基基因,构建pET-15b-CK、E.coli BL21(DE3)pLysS原核表达系统,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达.利用重组蛋白的组氨酸标签(His-tag)进行金属螯合亲和层析纯化,观察重组酶在不同保存条件下的稳定性.结果重组质粒经酶切及测序鉴定与预期相符,诱导表达后细菌裂解液上清酶活性可达280 000 U/L,纯化后SDS-PAGE在分子量45 000处显示单一蛋白条带,在-20 ℃加入70 g/L BSA、1 mmol/L DTT、2 mmol/L EDTA的PBS(pH 7.4)保存体系中,重组酶活性在30 d观察期内基本不变.结论成功表达并纯化了人肌酸激酶MM同工酶,重组酶稳定性良好,初步具备了作为基因工程人源酶校准品的基本特点.
作者:黄燕;杨文双;徐国宾;夏铁安
来源:临床检验杂志 2006 年 24卷 4期