目的构建以人midkine(MK)启动子调控的TK基因的重组复制缺陷型腺病毒.方法以AdenoXTM表达试剂盒为基础,应用分子克隆技术,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为MK启动子,并将由pHSV-106获取HSV-TK基因的编码序列亚克隆至其下游,酶切鉴定阳性重组穿梭质粒pShuttle-MK-TK.通过I-CeuI和PI-SceI两个稀有酶切位点,将目的基因与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得含目的基因的重组腺病毒质粒DNA,后者经限制性内切酶Pac Ⅰ切割后,两端露出反向末端重复序列(ITR),利用脂质体转染293细胞,获得含有目的基因重组腺病毒上清,PCR检测.结果酶切结果显示,MK启动子与TK基因均正向插入pShuttle中,TK位于MK启动子的下游.PCR检测显示重组腺病毒中含有MK启动子及TK基因片段.结论体外连接法可成功构建以人MK启动子调控的TK基因的重组腺病毒.
作者：陆春明；王荣；顾红光；陆建华；杨俊涛
来源：山东医药 2006 年 46卷 5期
