[目的]以pcDNA3.1(+)为骨架,构建并鉴定人脑胶质瘤组织中含R132H突变的人源异柠檬酸脱氢酶1基因(hIDHIR132H)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列的双顺反子真核表达载体.[方法]以内部核糖体进入位点(IRES)/EGFP片段为模板,扩增出IRES/EGFP片段,并在5′末端引入3×Flag标签；通过PCR介导的定点突变法,以pCMV-sports6-hIDH1为模板,扩增hIDH1R132H基因片段,并在3′末端引入3×Flag标签；通过PCR连接两种产物后经双酶切定向克隆入pcDNA3.1(+)骨架；转化大肠杆菌后挑取阳性克隆,提取质粒进行PCR检测及基因序列测定.[结果]PCR检测7个菌落中有6个阳性克隆,DNA测序发现引入了h1DH1基因.[结论]成功构建了双顺反子真核表达载体pcDNA3.1(+)-hIDH1 R132H/3 × Flag/IRES/EGFP,为研究人胶质瘤组织中R132H突变的作用机制奠定了基础.
作者：朱剑；许期年；王秀云；左剑玲；周岱；王中；伏林山；陈旭仁
来源：山东医药 2012 年 52卷 26期
