目的 构建缝隙连接蛋白(Cx)43基因shRNA慢病毒载体,并检测其对大鼠心肌细胞Cx43基因的作用.方法 针对Cx43基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成靶序列的双链DNA,接入pGCL-GFP载体,挑选阳性克隆行PCR鉴定及测序.用pHelper1.0和pHelper2.0质粒转染293T细胞,包装产生具备感染能力的慢病毒.以293T细胞中绿色荧光蛋白的细胞数量计算病毒滴度；以最适感染复数感染大鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察感染效率；应用real-time PCR和Western blot法检测大鼠心肌细胞.Cx43 mRNA及Cx43蛋白表达,并评价其抑制效果.结果 经PCR鉴定和测序证实,Cx43慢病毒载体构建正确,其病毒滴度为8×108 TU/mL、转染效率为82.59％.荧光定量real-time PCR法检测Cx43 mRNA的抑制率为96.10％,Western blot法检测Cx43蛋白的抑制率为77.16％.结论 成功构建了Cx43基因shRNA慢病毒载体,其能显著抑制大鼠心肌细胞Cx43基因的表达.
作者：陈立；钟国强；涂荣会；黎庆捷；何艳
来源：山东医药 2013 年 53卷 21期
