目的:本文利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a基因进行基因编辑,用于构建miR-29a基因敲除GT1-7细胞模型.方法:通过构建Cas9稳转的GT1-7细胞株并转染sgRNA质粒用于在靶向miR-29a基因区域引发突变.然后构建EGFP与sgRNA共表达质粒并转染Cas9稳转GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集表达绿色荧光蛋白的阳性细胞和分选阳性单克隆细胞.最后利用实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR)对富集细胞和单克隆细胞进行miR-29a表达量检测.结果:T7E1检测结果显示CRISPR-Cas9系统有效地在miR-29a基因区域引发了突变.荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,富集后阳性细胞miR-29a的表达量整体下降了50％左右(P＜0.05).此外,通过流式筛选获得了一个纯合miR-29a基因敲除细胞克隆,与对照组相比,其miR-29a的表达量下降了75％左右(P＜0.05).结论:本文建立了一种有效编辑GT1-7细胞基因的方法,并采用该方法构建了miR-29a稳定敲除细胞模型.
作者：王斯佳；李晓宁；李文文；李凯；肖君华；周宇荀
来源：现代生物医学进展 2016 年 16卷 21期
