目的:验证 miR-203通过与TLR4 mRNA 的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB 信号通路诱导M2 型巨噬细胞极化.方法:通过 miRanda 软件预测 TLR4 mRNA3'-UTR 存在 miR-203 结合位点.根据 TLR4 mRNA3'-UTR 序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以 pmirGLO 为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR43'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR43'-UTR). 将293T 细 胞 共 转 染 pmirGLO-TLR43'-UTR 质 粒 或 pmirGLO-mut-TLR43'-UTR 质 粒 及 mmu-miR-203-3p mimics 或 mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证 miR-203 可以与 TLR4 mRNA 的3'-UTR 特异性结合,通过 Real-time PCR 及 Western blot 验证小鼠巨噬细胞 RAW264.7 转染了 mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC 后,M1 型巨噬细胞 markers(iNOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2 型巨噬细胞 markers(Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及 TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达.使用 TLR4 抑制剂 TAK-242 抑制小鼠巨噬细胞 TLR4-Myd88-NF-κB 信号通路后,转染 mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测 M1,M2 型巨噬细胞 markers 及 TLR4-Myd88-NF-κB 信号通路的表达.结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T 细胞转染了 pmirGLO-TLR43'-UTR

作者：李登；沙明磊；陈磊；赵圣；邵怡

来源：现代生物医学进展 2018 年 18卷 17期