目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1,MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系.方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sgRNA),然后合成sgRNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sgRNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的mRNA和蛋白表达水平.结果:重组载体中含有正确的sgRNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在mRNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞.结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系.
作者：解晓露；王芳；裴培；成翕悦；包怡华；王珊；张霆
来源：现代生物医学进展 2019 年 19卷 10期
