目的:构建含MoMLV gag-pol基因的重组表达载体,实现其在NIH3T3细胞中稳定表达.方法:应用RT-PCR方法反转录并扩增gag-pol基因,克隆入真核表达载体pcDNA4/HisMaxA上,构建重组表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol,用脂质体法转染NIH3T3细胞,Zeocin筛选稳定表达细胞株,通过SDS-PAGE分析检测表明,gag-pol基因在NIH3T3细胞实现了表达,产物相对分子质量(kDa)为194.78×103.然后,将逆转录病毒载体导入此细胞系,包装逆转录病毒.用PCR与标记基因补救分析法检测野生型辅助病毒.结果:酶切鉴定的片段大小分别为5.2kb,与预期大小一致,经Zeocin筛选后获得稳定表达细胞株,SDS-PAGE实验表明产物融合蛋白相对分子质量(kDa)为194.78×103,与预期相符.脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒.结论:构建的融合表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol及其在NIH3T3细胞中的表达,构建成功具有靶向性的逆转录病毒包装细胞系,该细胞系能够包装出高滴度的逆转录病毒,为肝细胞的基因治疗提供了一种新的基因转移系统.
作者：王传玺；韩金祥；鲁艳芹；宋宝；刘杰
来源：中国生物工程杂志 2006 年 26卷 6期
