目的:构建RAB27A基因慢病毒表达载体,并研究RAB27A对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响.方法:以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板,PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长,酶切后插入穿梭载体pENTR/U6,再应用Gateway技术,基因重组到表达载体pHAGE-EF1 α-puro-DEST上,构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27 A-puro.测序鉴定序列正确后,将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装.收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞.荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度;Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A蛋白表达水平;CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况.结果:经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确;浓缩后病毒滴度较高;重组慢病毒感染HepG2细胞后,细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调,HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制(P＜0.01),S期细胞分布比例明显降低(P＜0.01).结论:RAB27A基因重组慢病毒表达载体构建成功,外源过表达RAB27A基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力.RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色.|

作者：刘雪杰；林巍然；唐立春；孙薇；魏汉东；姜颖

来源：中国生物工程杂志 2014 年 34卷 9期