髓样分化因子MyD88(myeloid differentiation factor 88)信号通路是一个具有多种调节功能的传导通路,在免疫反应、炎症反应及肿瘤的发生和发展过程中均发挥重要作用.构建猪(Sus scrofa)MyD88基因的shRNA干扰载体,并在转录水平和蛋白质表达水平对其干扰效果进行验证,以筛选出干扰效果最优的干扰载体.根据猪MyD88基因(GenBank登录号:KC766424.1)全长cDNA序列,利用Invitrogen公司在线设计软件设计出4对shRNA干扰序列,退火成双链后,分别将其插入到pYr-1.1载体中,构建MyD88基因的shRNA真核表达载体pYr-1.1-pigMyD88-sh1、pYr-1.1-pigMyD88-sh2、pYr-1.1-pig MyD88-sh3、pYr-1.1-pigMyD88-sh4,并通过双酶切和测序对其进行鉴定.构建成功后转染猪肺泡巨噬细胞3 D4/2,通过Real-time PCR及Western blot验证MyD88基因的表达水平,以及对LPS刺激后炎症因子TN F-α基因表达水平的影响.结果表明,所构建的猪MyD88基因的特异性shRNA表达载体均可显著降低猪MyD88 mRNA和蛋白质的表达水平(P＜0.05),干扰效率分别达到36％、67％、60％、69％;相比于未干扰组,LPS刺激MyD88沉默之后的巨噬细胞,炎症因子TNF-α基因表达水平显著下降(P＜0.05),表明所构建猪MyD88干扰载体干扰效果较好.

作者：宗鑫；胡汪洋；汪以真

来源：中国生物工程杂志 2015 年 35卷 7期