本研究设计和构建了一种人肿瘤坏死因子受体Ⅱ胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRⅡ-gAD,且相应的融合蛋白在哺乳动物细胞BHK-21S的无血清培养体系中实现了表达,并对该融合蛋白进行了初步鉴定.首先,用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区基因片段,与脂联素球部基因片段融合,克隆至pAAV2neo表达载体中,构建成pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD.随后,用pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD转染BHK-21S细胞获得G418抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD;然后,将原来含有血清的培养液换成无血清的化学成分限定的培养液,细胞从贴壁培养方式转换成悬浮培养方式;最后,收集BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD无血清悬浮培养24 h后的培养上清,进行sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的鉴定分析.酶切鉴定和测序结果显示,所构建的pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD质粒结构正确,sTNFRⅡ-gAD序列与预期一致;分别用抗人肿瘤坏死因子受体Ⅱ和抗人脂联素球部的单克隆抗体检测 pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD瞬时转染的BHK-21S细胞,免疫荧光呈现阳性;免疫印迹分析在pAAV2neo-sTNFRⅡ-gAD稳定转染的BHK-21S细胞上清中检测到sTNFRⅡ-gAD融合蛋白的表述,并以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在.活性测定结果表明,sTNFRⅡ-gAD融合蛋白具有显著抑制T
作者：陈素云；何秋山；董小岩；吴小兵；高基民
来源：生物工程学报 2010 年 26卷 2期
