为建立检测红色原鸡外周血单个核细胞（PBMC）中干扰素γ（IFN-γ）mRNA表达水平的方法，通过优化刀豆蛋白A（Con A）诱导PBMC表达IFN-γ的条件，采用RT-PCR方法以3-磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）基因为内参扩增IFN-γ基因，插入克隆载体pMD18-T分别构建重组质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH，以其作为标准品采用SYBR Green I染料法建立荧光定量PCR检测方法，并将该方法应用于34只红色原鸡PBMC IFN-γ表达量的检测。结果发现，PBMC在20μg/mL Con A刺激培养12-25 h时IFN-γ处于高表达水平；标准品质粒pMD-IFN-γ和pMD-GAPDH分别在拷贝数6.72×102-6.72×109、3.94×102-3.94×109范围内与其对应的Ct值呈现良好的线性关系（R2>0.99），扩增产物的熔解曲线均只有特异的单峰，表明所用引物特异性强。在优化Con A诱导红色原鸡PBMC表达IFN-γ条件的基础上，建立了可用于定量检测红色原鸡PBMC IFN-γmRNA表达水平的荧光定量PCR方法。
作者：孙亭亭；冀斌；马志亮；胡文丽；鲁琼芬；张雄伟；陈培富
来源：生物技术通报 2014 年 4期
