丙型肝炎病毒(HCV)依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)是参与病毒基因组RNA复制的一个关键蛋白因子,是研究抗HCV新型药物的重要靶标,获得纯化的RdRp 产物是建立靶向RdRp药物高通量筛选体系和抗病毒药物研究的关键步骤.以HCV病毒基因组全长cDNA质粒(p90/HCV FL?long pU)为模板,设计了特异性扩增RdRp的引物,通过CPR扩增获得编码RdRp的基因.将该基因克隆到T载体中,构建了重组质粒,通过克隆快速筛选和酶切分析筛选到含RdRp基因的阳性克隆(克隆号为44),DNA序列分析证实44号阳性克隆RdRp基因序列与cDNA质粒中的相应序列完全一致.将含RdRp基因的重组质粒(44号)用NheⅠ/XhoⅠ双酶切,获得RdRp基因,将该基因连接到用NheⅠ/XhoⅠ双酶切的原核表达载体pET28(a)中,构建了重组质粒pET2 8(a)/NS5B,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导,SDS?PAGE分析 ,发现一条特异性蛋白带,相对分子质量约66×103,与预期的完全一致.HCV RdRp基因的克隆与表达为靶向RdRp的新型抗HCV药物研究,特别是靶向RdRp药物高通量筛选技术的建立奠定了实验基础.
作者：陈忠斌；陆军波；管伟；王升启
来源：生物技术通讯 2000 年 11卷 4期
