目的 在细胞水平观察microRNA( miRNA)载体瞬时转染293T细胞株后对KiSS1基因转录、翻译的干预效应.方法 以SD大鼠基因组DNA为模板,克隆KiSS1基因全长序列,构建重组载体pcDNA3.1(+)-KiSS1.应用miRNA设计软件,针对大鼠KiSS1基因的4个不同靶位点设计4对于扰序列及1对非相关性的阴性对照序列,得到miRNA表达载体p-KiSSl -miRNAl-4及p-KiSS1-miRNA-neg.利用脂质体介导将上述载体与pcDNA3.1(+)-KiSS1共转染293T细胞,采用荧光显微镜及免疫荧光技术检测转染72 h后细胞中各载体表达.采用实时荧光定量-PCR (RT-RCR)及Western blot技术观察转染48 h及72 h后miRNA表达载体对KiSS1基因的干预效应.结果 荧光显微镜观察到miRNA载体转染293T细胞后可表达绿色荧光蛋白,免疫荧光结果显示转染pcDNA3.1(+)-KiSSl载体组可见红色的KiSS1蛋白在细胞质中表达；RT-PCR结果显示干预组细胞KiSSl mRNA表达显著低于阳性对照组和阴性对照组(Pa＜0.05).其中p-KiSS1-miRNA2组KiSS1基因表达抑制最显著,降低了85％；Western blot结果显示pKiSS1 -miRNA2干预组KiSS1蛋白表达明显低于阳性对照组及阴性对照组.结论 4个miRNA载体对大鼠KiSS1基因均具有抑制效应,其中针对KiSS1 mRNA序列304 - 324 bp的p-KiSS1 -miRNA2抑制效果最佳,为个体水平沉默K

作者：董红；李嫔

来源：实用儿科临床杂志 2012 年 27卷 8期