目的构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体,观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中表达.方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上,将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-RGN,将pEGFP-RGN转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-zeocin中,构建真核表达pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo的重组体,将pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,用脂质体转染入HK-2细胞,荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo表达情况.结果 RGN cDNA全长是897bp,以此构建的pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体,经DNA测序与GenBank中的人RGN cDNA序列一致.荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达.结论本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-EGFP-zeo真核表达质粒,并在HK-2细胞中表达.
作者：徐洪；胡亮；倪培华；吴洁敏；赵涵芳
来源：中国实验诊断学 2006 年 10卷 6期
