目的 构建针对人糖原合成激酶-3β(GSK-3β)基因的shRNA真核表达质粒,并筛选基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体;转染人胰腺癌细胞株PANC-1,建立稳定表达GSK-3β shRNA的细胞模型.方法 针对GSK-3β基因的mRNA序列设计并分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠埃希菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,采用Real-time PCR检测GSK-3β mRNA被抑制情况.选取抑制效应最强的重组质粒和阴性质粒转染的PANC-1细胞,经G418筛选后,建立稳定表达GSK-3β-shRNA的PANC-1细胞株(实验组)和稳定表达control-shRNA的PANC-1细胞株(阴性对照组).分别采用荧光显微镜和流式细胞术观察细胞的转染情况;Real-time PCR和Western blot分析GSK-3β的表达.结果 ①经测序证实,成功构建GSK-3β-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致;②重组质粒瞬时转染PANC-1细胞后,GSK-3β mRNA明显下调(P＜0.05),其中以2号重组质粒效应最强;③重组质粒稳定转染后检测PANC-1细胞中GSK-3β的表达,Real-time PCR和Western blot结果均提示:与未转染的阴性对照组和载体对照组比较,实验组中GSK-3β mRNA和蛋白的表达均显著降低(均P＜0.05).结论 成功构建了携带以GSK-3β为靶向的shRNA的重组质

作者：汪理；勾善淼；周伟；王统林；刘涛；王春友

来源：华中科技大学学报（医学版） 2011 年 40卷 2期