[目的]利用毕赤酵母真核表达系统表达蜡样芽孢杆菌胶原酶ColR75E,寻找一种安全、稳定的方式体外制备具有高活性的胶原酶.[方法]以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板,采用PCR法扩增胶原酶colR75E基因,构建pPICZαA/colR75E重组质粒,将该质粒线性化后电转化至毕赤酵母X-33菌株,诱导其表达并对表达条件进行优化.将表达后的酵母发酵液上清通过硫酸铵沉淀、脱盐处理及亲和层析纯化步骤获得高纯度重组ColR75E胶原酶.利用胶原酶活力测定、SDS-PAGE电泳、胶原酶谱、Ⅰ型胶原蛋白及不同底物蛋白降解产物电泳等方法对重组胶原酶ColR75E的活性及底物特异性进行分析.[结果]毕赤酵母中最佳表达重组胶原酶ColR75E的条件为pH 6.0,甲醇终浓度为2.5％,诱导时间72 h,诱导后的蛋白经SDS-PAGE、胶原酶谱以及l型胶原蛋白降解产物电泳分析发现,毕赤酵母中表达的重组胶原酶分子量符合预期,蛋白纯度超过95％,具有较好的胶原蛋白水解活性并测得其比活力为4.977 U/mg.该酶对Ⅰ型胶原蛋白表现出较好的专一性,但是对牛血清白蛋白、酪蛋白及溶菌酶蛋白没有水解活性.[结论]利用毕赤酵母真核表达系统能够获得高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶ColR75E,为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域奠定了理论和方法基础.
作者：张真；李晔；张西轩；胡双艳；阮海华
来源：微生物学通报 2017 年 44卷 4期
