[背景]光学纯L-苯乳酸是一种天然防腐剂,也是一种高附加值的手性分子,在食品、制药和材料等领域有广阔的应用前景.本实验室已发现来源于Lactobacillus casei CICIM B1192的NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH)可不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸,但其活性较低.为提高L-LcLDH催化苯丙酮酸的催化效率,构建了一个单突变体L-LcLDHQ88R,其催化效率kcat/Km是L-LcLDH的4.9倍.[目的]为进一步提高L-LcLDHQ88R催化苯丙酮酸的催化效率,采用饱和突变技术将位于L-LcLDHQ88R底物结合口袋附近的氨基酸残基Ile229随机替换为其他氨基酸,以获得活性更高的优良突变体.[方法]以重组表达质粒pET-22b-LcldhQ88R为模板,采用全质粒PCR技术对L-LcLDHQ88R基因(LcldhQ88R)中编码Ile229的密码子实施饱和突变,构建突变转化子文库.以催化苯丙酮酸的活性为指标,从文库中筛选出优良的突变转化子.[结果]突变转化子(Escherichia coli/LcldhQ88R/I229Q)表达出一种由Arg和Gln分别替换了Gln88和Ile229的双突变体L-LcLDHQ88R/I229Q.重组表达产物L-LcLDHQ88R/I229Q的酶学性质分析表明:L-LcLDHQ88R/1229Q的比活性是L-LcLDH的18.5倍,是L-LcLDHQ88R的2.3倍;其催化效率分别为后两者的6.8倍和1.4倍.L-LcLDH突变前后的温度和pH特性改变不大.根据分子对接结

作者：李雪晴；刘艳；袁风娇；李剑芳；邬敏辰

来源：微生物学通报 2018 年 45卷 7期