目的:在前期微囊化基因工程细胞制备平台的基础上,构建分泌型人肿瘤坏死因子α的真核表达载体PSNAV2.0-TNFα重组质粒,并鉴定其蛋白的体外瞬时表达,为进一步利用该基因进行微囊化细胞移植治疗和改善疾病奠定基础.方法:实验于2006-06/2007-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学实验室完成.①以含有人肿瘤坏死因子αcDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得人肿瘤坏死因子α基因片段;将其定向插入真核表达载体PSNAV2.0中,获得重组质粒PSNAV2.0-TNFα.采用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒.②利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾细胞HEK-293细胞中,构建可持续分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,采用RT-PCR法和Western blot法检测转染细胞培养上清液中人肿瘤坏死因子蛋白的体外瞬时表达.结果:①通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明:在HEK-293中插入片段正确.②采用RT-PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有人肿瘤坏死因子α蛋白,Mr17 000.结论:成功构建了重组质粒PSNAV2.0-TNFα真核表达载体,转染HEK-293细胞后可有效分泌人肿瘤坏死因子α蛋白,并能分泌到细胞外.
作者：高宇红；薛毅珑；刘建伟；崔忻
来源：中国组织工程研究与临床康复 2007 年 11卷 42期
