背景:血管内皮生长因子能促进内皮细胞分裂增殖及血运重建,诱导血管生成,近年来以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床.但质粒载体转染率低、腺病毒载体对机体的免疫原性及存在潜在感染危险等问题尚需探讨.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,鉴定并测定病毒滴度及活性.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/09在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司;Ecoli DH5.菌株由陕西省疾病预防控制中心保存:AAV helper-free system腺相关病毒包装系统中pAAV-IRES-hrGFP质粒包含绿色荧光报告基因,购自Stratagene公司;重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建.方法: 从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,插入腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此重组质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper磷酸钙法共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.荧光显微镜下监测病毒包装效率,裂解AAV_293细胞收获重组病毒并进行浓缩纯化.应

作者：黄向辉；时志斌；王坤正；党晓谦；杨佩；余鹏博

来源：中国组织工程研究与临床康复 2008 年 12卷 29期