背景:Survivin在多种肿瘤组织中的高表达,具有调节细胞增殖分裂和强大的抗凋亡功能.目的:利用RNA干扰技术,构建具有特异性阻断C_(57)BL小鼠survivin基因的微小RNA(micro RNA,miRNA)表达载体.设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/11在重庆医科大学附属第一医院神经内科实验中心完成.材料:环形pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFPmiR和BLOCK-iT~(TM) Pol II miR RNA干扰 Expression Vector Kit with EmGFP为Invitrogen公司产品;DH5a大肠杆菌为实验室保存;xho I和BamH I酶、壮观霉素均为上海生工生物工程有限公司产品.方法:应用设计软件在C_(57)BL小鼠survivin基因的mRNA上寻找特异性的短核苷酸序列,并设计合成4对寡核苷酸序列,经退火后形成双链DNA片段,采用基因克隆技术,将其克隆到pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFPmiR的载体中,转化DH5a大肠杆菌,挑单菌落种于含有壮观霉素LB液体培养基中,提取质粒.主要观察指标:应用测序法和琼脂糖电泳检测对重组体进行鉴定.结果:测序结果显示插入片段与线性载体连接正确,无碱基突变、缺失、插入等异常.双酶切处理pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFP-miR重组质粒结果显示片段大小与预期相符.结论:实验结果表明成功构建了C_(57)BL小鼠survivin基因的微小RNA表达载体.

作者：王海峰；苟欣；黎衍敏；何卫阳；杨华安

来源：中国组织工程研究与临床康复 2009 年 13卷 53期