[目的]建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测. [方法]体外转录黄热病病毒5-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索最佳反应体系条件并用于黄热病疫苗和入境发热患者标本的检测.[结果]建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:2xRT-PCR缓冲液10 μl,正向引物5UTR-FP终浓度750 nM,反向引物5UTR-RP终浓度750 nM,探针5UTR-Probe终浓度500 nM,25xRT-PCR Enzyme Mix 0.8μl,RNA 5μl,用DEPC H2O补足到反应总体积20μl;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,56℃10 s(single),72℃15 s,45次循环.该方法最低检测限约为20copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应.应用该方法对黄热病疫苗、媒介蚊虫和入境发热患者的血清标本进行检测,结果为黄热病疫苗核酸阳性,其他标本为阴性.[结论]该实时荧光RT-PER方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验,防止该病在国境口岸的传入.
作者：师永霞；相大鹏；郑夔；李小波；黄吉城；洪烨；幸芦琴；郭波旋
来源：现代预防医学 2010 年 37卷 4期
