目的 GAA基因突变是人类II型糖原贮积病的遗传学病因,目前尚无根治方法.文章拟设计可模拟人类GAA基因强致病位点突变的靶向小鼠Gaa基因的CRISPR/Cas9系统,并在细胞水平验证其打靶效力.方法 检索OMIM、ExAC以及ClinVar等数据库筛查人类Ⅱ型糖原累积病致病基因GAA的强致病位点.通过人和小鼠GAA蛋白序列比对分析将筛查到的强致病位点定位于小鼠基因组上.根据定位区域的小鼠基因组DNA序列,设计了3个向导RNA序列(Small Guide RNA,sgRNA)序列.然后构建了3个sgRNA表达载体,并将3个sgRNA表达载体分别与cas9表达质粒共转染小鼠N2a细胞.通过嘌呤霉素和杀稻瘟菌素进行药物筛选,收取阳性转染细胞.PCR扩增打靶区域DNA片段,利用T7EN I酶切反应和sanger测序初步分析打靶情况.随后通过高通量测序分析基因型和打靶效率.结果 根据筛查结果判定人GAA蛋白的p.Tyr609位点为强致病位点,与小鼠Gaa蛋白的p.Tyr609位点相对应;根据小鼠Gaa蛋白p.Tyr609位点的DNA序列,成功构建了3个靶向该位点的sgRNA表达质粒;药筛阳性细胞打靶位点的PCR扩增产物测序及T7EN I酶切反应表明3个位点均发生了DNA变异;高通量测序结果表明3个位点的突变效率分别为49.45％、71.23％和70.91％.结论 成功构建了靶向小鼠Gaa基因的高效CRISPR/Cas9系统,为深入研
作者：岳鹏鹏；唐琴艳；李欣怡；陈玲；付灿；于鸿浩
来源：医学研究生学报 2020 年 33卷 10期
