目的 构建含有miR-363-3p的慢病毒表达载体,获得能够稳定表达miR-363-3p的DU145细胞株并初步进行细胞形态学实验.方法 利用PCR扩增miR-363-3p片段,插入慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-tRFP中构建重组慢病毒质粒pCDH-miR-363-3p.将慢病毒包装三质粒表达系统的重组慢病毒质粒pCDH-miR-363-3p,包装质粒psPAX以及包膜质粒pMD2.G共转染人胚肾上皮细胞(HEK293T)细胞中,同时以慢病毒空载体pCDH-vector作为阴性对照.收集含有病毒颗粒细胞的病毒上清液,测定Lentivirus-miR-363-3p和Lentivirus-vector的病毒滴度.再用重组慢病毒Lentivirus-miR-363-3p及阴性对照Lentivirus-vector以相同感染复数(MOI)的病毒量分别感染DU145细胞,72 h后,在荧光显微镜下通过观察红色荧光蛋白(RFP)的表达情况观察被感染细胞数.采用反转录实时定量PCR (RT-qPCR)方法检测两组细胞系中miR-363-3p表达情况.将获得的两组细胞进行平板划痕实验,初步观察其细胞生长行为的差异.结果 PCR成功扩增出miR-363-3p片段,插入慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-tRFP后,利用限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实重组慢病毒质粒pCDH-miR-363-3p构建成功.通过慢病毒包装三质粒表达系统获得表达miR-363-3p的重组慢病毒,测得滴度约为1.5×107 efu/ml.以相同MOI的重

作者：肖荣；杨元强；汪洋；王纯才；包文平；葛东升；冯宁翰

来源：中国临床研究 2016 年 29卷 7期