目的:构建表达大鼠核因子κB(NF-κB, p65)反义RNA的重组腺病毒,并测定受染血管平滑肌细胞(VSMCs)中NF-κB基因的表达变化.方法:从自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)的VSMCs中提取总RNA,经RT-PCR方法获得含全部编码序列的NF-κB (p65)cDNA片段(1 653 bp),用TA克隆技术插入pMD18-T载体,构建pMD18-T/1653重组质粒,并经酶切和DNA测序鉴定.以该质粒为模板,经PCR获得NF-κB(p65)3'端 269 bp 片段,逆向插入pcDNA3.1(+)真核表达载体并置于CMV启动子下.由此构建的pcDNA3.1(+)/269质粒含有NF-κB(p65)的269 bp反义RNA完整表达框.随后将该表达框克隆到入门载体pENTR4,构建重组质粒pENTR4/CMV/269.使用同源重组方式在体外将该表达框重组到腺病毒载体pAd/PL-DEST,最终得到重组腺病毒质粒pAd/CMV/269.线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞后产生的重组腺病毒颗粒用于VSMCs的感染.Western Blot测定感染前后VSMCs中NF-κB(p65)表达的变化情况.结果:构建的pMD18-T/1653重组质粒经过序列测定,证实其包含大鼠NF-κB(p65)基因的1653 bp片断;pcDNA3.1(+)/269、pENTR4/CMV/269、pAd/CMV/269等重组质粒经内切酶消化或PCR等方法鉴定无误;线性化的pAd/CMV/269转染293细胞后,可产生完整、具有感染性的重组腺病

作者：胡榕；吴可贵；许昌声

来源：中国临床药理学与治疗学 2005 年 10卷 4期