目的 构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并检测其在K562细胞中的表达.方法 以质粒pGBKT7-PML-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,与穿梭质粒dTrace-TO4连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TO4-NLS-RARα,经Pme Ⅰ酶切线性化后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα,经Pac Ⅰ酶切线性化后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα,经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度,并进行PCR及测序鉴定;将重组腺病毒感染K562细胞,采用流式细胞术测定感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NLS-RARα在K562细胞中的转录及表达水平.结果 重组腺病毒Ad-NLS-RARα经4轮扩增后,滴度可达6.9×lO8 pfu/ml,PCR及测序鉴定证明构建正确,对K562细胞的感染效率可达70%左右;重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可在K562细胞中高效表达.结论 已成功构建了重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并在K562细胞中高效表达了NLS-RARα基因.
作者:胡秀秀;刘北忠;钟梁;高远梅;张曦;吴秀娟;王慧;朱新瑜
来源:中国生物制品学杂志 2013 年 26卷 7期