目的 原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuber-culosis,MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白(recombinant ESAT6-CFP10,rEC),并优化表达条件.方法 以(GGGGS)3为linker将ESAT6和CFP10两个基因连接,合成rEC全基因,插入至载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-rEC,转化至感受态E coli BL21(DE3),筛选优势菌株进行诱导表达,并对诱导温度(25、30、37℃)、诱导剂种类及浓度(0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L IPTG及0.5、1、5、10、15、20 g/L乳糖)、诱导时间(2、3、4、5、6h)、诱导起始A600(0.4、0.6、0.8、1.0)进行优化.菌种经5L发酵罐发酵培养后,采用亲和层析及离子交换层析纯化rEC融合蛋白,于-20℃分别储存0、2、4、6个月,12.5％ SDS-PAGE分析rEC融合蛋白,并对保存0、6月的样品进行HPLC-SEC分析.结果 重组质粒pET-28a-rEC经双酶切及测序鉴定,构建正确.rEC融合蛋白最适诱导条件为:于30℃,以0.1 mmol/L IPTG诱导4h.纯化后rEC融合蛋白纯度达95％以上,且可与鼠抗ESAT6单克隆抗体发生特异性结合,于-20℃保存6个月未见蛋白降解及聚体产生.结论 原核表达了rEC融合蛋白,并优化了其表达条件,获得的rEC融合蛋白具有较高纯度及稳定性.
作者：杨晰朦；陈香梅
来源：中国生物制品学杂志 2020 年 33卷 3期
