为建立一种快速检测新孢子虫的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据GenBank中登录的新孢子虫Nc-5基因序列(X84238.1)设计2对特异性引物,通过PCR扩增将新孢子虫Nc-5基因片段并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒pMD18-T-Nc-5,并经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品.通过优化该方法的引物浓度、反应温度,并利用LAMP浊度仪测定扩增目的基因时出现白色焦磷酸镁的浊度值实时监控反应进程,初步建立了检测新孢子虫的LAMP方法,反应结束后通过加入SYBR Green Ⅰ观察荧光对结果可视化判定.反应条件优化结果显示,引物F3/B3和FIP/BIP的终浓度分别为10 pmol/μL、20 pmol/μL,63 ℃扩增40 min效率最佳.利用该方法检测新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫、环形泰勒虫、双芽巴贝斯虫、伊氏锥虫核酸,并在反应结束后加入SYBR Green Ⅰ观察荧光以评估该方法的特异性.结果显示仅新孢子虫核酸扩增为阳性,其余病原核酸均为阴性结果.荧光观察结果显示,新孢子虫反应管呈翠绿色荧光(阳性),其他反应管呈橙黄色荧光(阴性);对重组质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板(即4.0×107拷贝/μL～4.0×100拷贝/μL)进行LAMP的敏感性试验,结果显示该方法对质粒标准品的检测限为4.0×101拷贝/μL,且在反应结束后加入SYBR Green I,4.0×107拷贝/μL～
作者：王雅华；王准；刘博；肖芳；龚贺；王伟利；王向辉
来源：中国预防兽医学报 2023 年 45卷 6期
