目的 构建高效表达人β3-肾上腺素受体(hβ3-AR)的真核细胞表达载体,为进一步研究hβ3-AR的功能以及与过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2 (PPAR-γ2)调控基因之间的相互影响奠定基础.方法 从人肾旁脂肪组织提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增hPPAR-γ2、hβ3-AR cDNA全长序列.将EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的hβ3-AR cDNA与同样进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA 3.1(+)载体连接形成重组载体pcDNA 3.1(+)/hβ3-AR.将XbaⅠ和AflⅡ双酶切后的hPPAR-γ2 cDNA与同样进行XbaⅠ和AflⅡ双酶切的pcDNA 3.1(+)载体连接形成重组载体pcDNA 3.1(+)/hPPAR-γ2.通过限制性内切酶酶切鉴定后对DNA序列进行测序,鉴定重组质粒中hβ3-AR和hPPAR-γ2基因的完整性和可靠性.运用定点诱变方法,对野生型hPPAR-γ2和hβ3-AR质粒进行定点诱变,构建Pro12Ala突变的hPPAR-γ2和Trp64Arg突变的hβ3-AR的pcDNA 3.1(+)载体,电穿孔法将人hβ3-AR重组表达载体pcDNA 3.1(+)/hβ3-AR(突变型和野生型) 转染到SH-SY5Y细胞中,用G418筛选获取稳定转染细胞株,并用RT-PCR、Western blot方法进行鉴定.结果 酶切和测序分析显示重组质粒构建正确,并在转染的SH-SY5Y细胞中获得hβ3-AR的高效表达.结论 成功克隆了人PPAR-γ2、β3-AR基因全长cDNA

作者：黄琼；赵昕；李慧华；尹继业；周宏灏；刘昭前

来源：中国药理学通报 2008 年 24卷 4期