目的 构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3.1-myc/PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达.方法 用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA.该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点.将所得片段连接到T载体上测序证实.利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B上,酶切鉴定.通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48 h后利用RT-PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况.主要观察指标:(1)PINK1基因cDNA扩增产物检测.(2)pcDNA3.1-myc/PINK1重组体酶切鉴定.(3)Western-blotting.结果 经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3.1-myc/CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48 h后的COS-7细胞可检测到P1NK1蛋白的表达.结论 PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达.
作者：张玉虎；刘越存；李少华；王丽娟
来源：中国医师杂志 2009 年 11卷 12期
