目的 构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体.方法 采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、转化、筛选、鉴定后,将Western blot检测表达正确的重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体再经酶切、电转入BJ5183感受态细胞(已包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)同源重组,并筛选、鉴定、扩增.通过Pacl酶切后,以快速简便的乙醇沉淀法替代传统的酚-氯仿-异戊醇法回收酶切产物,用高效低毒高稳定性的FuGENE HD转染试剂替代传统的lipofectamin 2000转染低代数的HEK293A包装细胞,进行病毒包装.包装后的重组腺病毒感染结直肠癌细胞HCT 116,Western blot检测以确认NLK及其突变体蛋白的表达.结果 经PCR、测序及Western blot检测证实,成功构建了携带NLK基因及其突变体的腺病毒载体,PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液,扩增后感染结直肠癌细胞HCT 116能正确表达NLK蛋白及其突变体蛋白.结论 成功制备NLK基因及其突变体重组腺病毒,可进一步用于NLK生理功能的研究.
作者：程筱雯；梁俊波；缪时英；王琳芳
来源：中国医学科学院学报 2011 年 33卷 6期
