目的 构建人IL-12(hIL-12)p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞(hMSC).方法 根据hIL-12 p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增,将扩增所得p40和p35片段采用overlap PCR法拼接,获得的rhIL-12融合基因与pGEM-T Easy质粒连接,将鉴定正确的pGEM-T/rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,构建pcDNA3.1(+)/rhIL-12真核表达载体,并进行测序鉴定.将鉴定正确的pcDNA3.1(+)/rhIL-12经脂质体介导转染hMSC,同时以转染pcDNA3.1(+)空质粒作为对照组,在倒置显微镜下观察细胞生长形态;在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达:另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平.结果 PCR扩增结果显示特异性扩增出p40(1000 bp)、D35(600 bp)、rhIL-12(1600 bp)片段,均与预期DNA表达片段大小一致.pcDNA3.1(+)/rhIL-12测序显示克隆的rhIL-12基因序列与报告序列完全相同.倒置显微镜下观察,可见转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异.蛋白质印迹和ELISA检测显示,转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL.12融合蛋白的持续表达:而对照组中

作者：高鹏；丁强；方祖军；郑捷

来源：中国医药生物技术 2008 年 3卷 3期