目的:通过CRISPR-Cas9基因编辑技术及质粒电转染技术制备T细胞免疫球蛋白黏液素3 (TIM3) 基因敲除的人外周血T淋巴细胞, 探讨敲除TIM3基因后能否增强T细胞免疫功能及其抗肿瘤作用.方法:通过电转染法将hTIM3 sgRNA/Cas9双质粒共转染EBV阳性胃癌患者外周血T淋巴细胞, 电转24 h后流式细胞术检测转染效率并利用荧光显微镜观察;体外培养过程中观察基因敲除后T细胞增殖活性, 流式细胞术验证TIM3基因敲除效率以及细胞表型的变化.用肿瘤抗原肽活化T细胞检测TIM3基因敲除后T细胞分泌细胞因子水平及体外杀伤胃癌AGS-EBV细胞的能力.结果:电转染法能够有效地将hTIM3 sgRNA/Cas9双质粒敲除体系转入人外周血T淋巴细胞, 其转染效率平均达 (41.5±3.6) ％, 基因敲除效率波动在40.0％～50.0％ (均P<0.01);经抗原活化后的基因敲除组T细胞的增殖活性和免疫表型未见明显变化, 表面活化分子中仅见HLA-DR较对照组明显提高 (P<0.05);TIM3基因敲除T细胞分泌TNF-α、IFN-γ的水平显著增高 (P<0.01或P<0.05), 体外杀伤胃癌AGS-EBV细胞的能力也明显增强 (均P<0.05) .结论:用CRISPR-Cas9基因编辑及质粒电转染技术制备人外周血TIM3基因敲除T淋巴细胞的方法简易可行, 在体外的扩增活化中保持TIM3基因水平下调并具有更高的免疫应答水平以
作者：王康馨；赵阳；苏舒；邵洁；魏嘉；刘宝瑞
来源：中国肿瘤生物治疗杂志 2019 年 26卷 4期
