目的 构建含有人E2F2基因和绿色荧光蛋白基因(pEGFP)的腺病毒载体,为聋病的基因治疗奠定实验基础.方法 根据已知的E2F2基因序列设计并合成相应的双链DNA,将其与酶切线性化的pDC315-EGFP载体片段连接,构建穿梭质粒pDC315-GFP-E2F2,并将其与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒.对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定.用聚合酶链反应和测序方法 验证穿梭质粒pDC315-GFP-E2F2穿梭质粒的构建;通过荧光显微镜和Western blot(蛋白质印迹)方法,分别检测质粒pDC315-GFP-E2F2和重组腺病毒表达E2F2蛋白情况.结果 经聚合酶链反应鉴定和测序分析.证实穿梭质粒pDC315-GFP-E2F2与设计一致;经荧光显微镜检测,分别由穿梭质粒pDC315-GFP-E2F2、重组腺病毒转染的HEK293细胞均可观察到GFP表达;经Western Blot检测出在72 kDa～95 kDa处有条特征带,其大小和E2F2-GFP融合蛋白(～76 kDa)相吻合;滴度测定为1×1011 PFU/ml(PFU,plaque forming unit,空斑形成单位).结论 成功构建了人E2F2基因重组腺病毒载体,并能在HEK293细胞中表达.
作者：王琳；杨仕明；郭维维；余力生
来源：中华耳科学杂志 2010 年 08卷 4期
