目的 利用RNA干扰技术沉默宫颈癌HeLa细胞中DNA甲基转移酶(DNMT)1基因的表达,探讨沉默DNMT1基因后对HeLa细胞增殖及凋亡的影响.方法 针对DNMT1基因构建短发夹状RNA(shRNA)重组载体pshRNA-DNMT1-A、B和C质粒,并行酶切鉴定和测序分析.采用RT-PCR技术筛选出其中RNA干扰效果最佳的重组载体,通过脂质体介导转染宫颈癌HeLa细胞(转染组),以空载体组(转染空载体pSilencer3.1-H1质粒)和未转染组(未作任何处理)为对照.采用RT-PCR技术和蛋白印迹法分别检测转染前后HeLa细胞中DNMT1 mRNA和蛋白表达的变化,活细胞计数(CCK-8)法和双染法流式细胞术分别检测转染前后HeLa细胞增殖和凋亡的变化.结果 (1)酶切鉴定和测序分析证实,靶向DNMTI的3个shRNA重组载体pshRNA-DNMT1-A、B和C质粒构建成功.RT-PCR技术筛选显示,重组载体pshRNA-DNMT1-B质粒的干扰效果最佳.(2)RT-PCR技术检测显示,转染组转染24、48及72 h时HeLa细胞中DNMT1 mRNA的相对表达水平分别为0.406±0.057、0.191±0.036、0.104±0.015,明显低于空载体组和未转染组(分别为0.520±0.020、0.537±0.041,P＜0.05).蛋白印迹法检测显示,转染组转染24、48及72 h时细胞中DNMT1蛋白的相对表达水平分别为0.197±0.024、0.075±0.015、0.040±0.013,明显低于卒载体组和未转染

作者：赵先兰；饶燕玲；乔玉环；张会利

来源：中华妇产科杂志 2009 年 44卷 7期