目的:探讨运用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)基因敲除的小鼠模型,为小鼠原发骨肉瘤模型建立前期基础。方法:根据Hsf1基因结构的第9外显子选择相应的gRNA(guide RNA)并进行筛选,通过PCR扩增出sgRNA(small guide RNA)转录模版,得到4个上游引物。随后将sgRNA进行体外转录并通过TubeScreen平台筛选,筛选切割有效的sgRNA,从筛选结果中选取切割效率最高的sgRNA用于后续实验。运用PCR扩增出转录spCas9mRNA的模板,接着体外转录Cas9mRNA。将体外转录得到的sgRNA与Cas9mRNA一起注射入健康的C57BL/6小鼠受精卵内,剪取出生小鼠尾巴提取组织并进行PCR测序鉴定。选取F0代杂合子母鼠与野生型公鼠交配得到F1代子鼠,结合琼脂凝胶电泳和基因测序检测F1代鼠基因碱基的突变情况。选取F1代杂合子公鼠与F0代母鼠回交得到F2代子鼠,剪取鼠尾组织并测序,最终得到F2代纯合子敲基因小鼠。运用PCR观察sgRNA切割效率与鼠尾组织的测序,通过观察凝胶电泳结果来判断小鼠是否为杂合,同时利用snapgene软件进行基因序列比对判断碱基片段缺失。结果:经PCR扩增得到上游引物sgRNA-1primer-F、sgRNA-2primer-F、sgRNA-3primer-F、sgRNA-4primer-F与下游引物sgRNAprimer-R。经过sgRNA
作者:吴哲宇;周振华;吴志鹏;张雨峰;杨志强;朱宇凡;谢远龙;肖建如;蔡林
来源:中华骨科杂志 2021 年 41卷 8期