目的 稳定表达重组成人型乙酰胆碱受体(ε-nAChR)和胎儿型乙酰胆碱受体(γ-nAChR)细胞株的构建.方法 通过亚克隆技术将含有乙酰胆碱受体亚基基因的原核细胞表达质粒pSP65a、pSP65β、pSP64γ、pSP65δ和pBssKε分别连接到真核细胞表达质粒pcDNA3.1构建阳性重组子pcDNA3.1α、pcDNA3.1β、pcDAN3.1γ、pcDNA3.Iδ及pcDNA3.1ε,并将含有α、β、δ、ε或α、β、δ、γ亚基基因的重组子按摩尔比2:1:1:1(质粒总量<1.5μg)转染HEK293细胞.采用G418筛选出有ε或γ亚基基因表达的阳性细胞株,再采用免疫荧光法筛选出表达ε-nAChR或γ-nAChR的细胞株,进一步采用全细胞膜片钳技术选出乙酰胆碱诱发ε-nAChR或γ-nAChR产生内向电流的细胞株.结果 酶切鉴定结果显示pSP65α、pSP65β、pSP64γ、pSP65δ和pBssKε均正确定向插入pcDNK3.1.未传代、连续传10代及冻存并复苏的表达ε-nAChR和γ-nAChR的细胞株均可呈现稳定的免疫荧光,荧光主要分布在细胞膜表面.乙酰胆碱刺激后,6株转染ε-nAChR的细胞上记录到100～400 pA内向电流,3株转染γ-nAChR的细胞上记录到200～600 pA内向电流.结论 成功构建出稳定表达ε-nAChR和γ-nAChR的细胞株.
作者：杨斌；周雅春；王宏；李士通
来源：中华麻醉学杂志 2008 年 28卷 12期
